NeuroFUS论文分享：Theta Burst 经颅超声刺激（tbTUS）诱导人类运动皮层可塑性

2022年初, 加拿大多伦多大学Krembil研究所的Robert Chen实验室曾科博士等在**的Annals of Neurology杂志（影响因子：11.274）上发表标题为Induction of Human Motor Cortex Plasticity by Theta Burst Transcranial Ultrasound Stimulation 的研究论文。该研究提出了Theta-burst模式经颅超声刺激 (tbTUS) ，并用经颅磁刺激 (TMS) 诱导的运动诱发电位 (MEP) 评估运动皮层在80秒tbTUS刺激后的兴奋性变化，确定了tbTUS可以增强运动皮层兴奋性至少30分钟，而且拥有较强的尺度效应和较低的个体间变化度。本研究提出tbTUS极有可能成为新的非侵入神经调控治疗方案。此外，TUS具有高空间分辨率和深刺激深度，因此还可以刺激大脑深层区域，为需要对大脑深部区域进行神经调控的疾病开辟现今**的非侵入性治疗途径。本研究中所采用的超声刺激设备，与NeuroFUS系统同款，均为Sonic Concepts公司产品。

全文基于ChatGPT翻译整理如下供参考，论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ana.26294：

Theta Burst 经颅超声刺激（tbTUS）诱导人类运动皮层可塑性

论文摘要：

目标：经颅超声刺激（TUS）是一种有前景的非侵入性脑部刺激技术，具有高空间精度和能够瞄准深层脑区的优势。本研究旨在开发一种TUS方案，有效地诱导人体主体的脑可塑性。

方法：在健康受试者的运动皮层中，分别进行了80秒的theta burst模式的TUS（tbTUS），持续时间相同的定期模式的TUS（rTUS）以及假性tbTUS。采用经颅磁刺激（TMS）来检测皮质脊髓兴奋性、皮层内抑制和促进的变化以及可塑性诱导的位置。还测试了运动皮层tbTUS对视运动任务的影响以及枕叶皮层tbTUS对运动皮层兴奋性的影响。

结果：tbTUS在至少30分钟内产生一致的皮质脊髓兴奋性增加，而rTUS和假性tbTUS没有产生显著变化。tbTUS降低了短间隔皮层内抑制并增加了皮层内促进。TMS在不同电流方向上的效应表明可塑性变化的位置在运动皮层内。对枕叶皮层的tbTUS没有改变运动皮层兴奋性。运动皮层tbTUS缩短了视运动任务的运动时间。

解释：tbTUS是一种新颖高效的范式，可以在人体中诱导皮质可塑性。它有潜力用于神经调控治疗神经和精神疾病，并推动神经科学研究的进展。

长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）可塑性可以通过现有的非侵入性脑刺激技术在人类大脑诱导出来，例如经颅磁刺激（TMS）和经颅直流电刺激（tDCS）。然而，目前的非侵入性脑刺激方法在空间特异性和穿透深度方面存在限制，阻碍了它们在基础和临床神经科学中的广泛应用。一种新兴的非侵入性脑刺激方法是低强度经颅超声刺激（TUS），它可以通过将声波传播聚焦到选定的焦点区域，以毫米级空间精确度瞄准深部脑区域。人体的先驱性研究表明，TUS是一种安全的方法，可以通过刺激人类皮层和皮下区域来短暂调节脑活动。然而，为了将TUS作为潜在的神经和精神疾病治疗方法，需要在刺激后诱导出更持久的改变。

持久的效果可以通过重复TUS实现，因为每次重复刺激可以增加传递到目标区域的声能，同时避免累积组织加热。重复刺激策略在重复经颅磁刺激（rTMS）中被广泛使用。例如，5Hz或更高频率的rTMS增加皮层兴奋性，1Hz或更低频率的rTMS降低皮层兴奋性。最近的研究表明，重复TUS协议的脉冲持续时间从0.5到50毫秒，脉冲重复频率（PRF）从10到100Hz，在小型动物、大型动物、非人类灵长类动物和人类中产生持久的神经调节效应。此外，在动物模型中，TUS的应用可以抑制异常的病理性神经振荡，如癫痫性脑电图（EEG）爆发和帕金森病相关的皮层β-γ耦合。虽然上述研究通过功能性磁共振成像（fMRI）、EEG和行为变化观察到了刺激后效应，但无法确定脑的兴奋性是增加还是减少。此外，这些研究中使用的TUS协议在声波参数和刺激后效应的持续时间方面存在差异。

本研究的目的是利用穿透完整颅骨的重复经颅超声刺激（TUS）在人类大脑运动皮层上诱导出持久的可塑性。我们使用经颅磁刺激（TMS）引发的运动诱发电位（MEPs）以无痛和非侵入性的方式客观量化运动皮层兴奋性的变化（图1）。这种方法已被广泛用于确定已建立的非侵入性脑刺激协议的刺激后效应。本研究引入的重复TUS协议是由重复频率为5Hz的超声脉冲（0.5MHz）20毫秒爆发构成的持续80s的train（图2A）。由于爆发重复频率（5Hz）对应于与学习和记忆过程相关的海马节律频率，我们将这个TUS协议称为theta burst TUS（tbTUS）。tbTUS、常规的TUS（rTUS）和假性tbTUS被随机顺序分别在同一组被试的不同天交付到运动皮层。rTUS由较短的脉冲（0.32毫秒）和更高的重复频率（1,000Hz）组成（见图2B），旨在具有与tbTUS相同的总超声刺激持续时间（8秒）和协议时间（80秒）。此外，tbTUS还被交付到同侧枕叶皮层作为皮层位置的主动对照。我们发现，tbTUS在人类运动皮层中诱导的LTP样可塑性持续了30到60分钟。这种效应特异于对运动皮层的tbTUS刺激，并且不太可能是由于感觉混淆所致。通过tbTUS以非侵入性、无痛和可逆的方式诱导持久的皮层兴奋性变化的可行性，使这种技术成为在人类中诱导神经可塑性的潜在有价值的工具。

图1：实验设置。 （A）实验设置的示意图，使用经颅磁刺激（TMS）在左侧运动皮层上诱发对侧右侧**背间骨肌（FDI）肌肉中的运动诱发电位（MEPs）。TMS引发从后向前（PA）方向的电流在大脑中经过经突触方式激活皮质脊髓神经元，而从侧向-内向（LM）方向的电流直接激活皮质脊髓轴突。除非另有说明，TMS是以PA方向进行的。MEPs通过一对表面电极从放松状态的FDI肌肉中记录。MEP幅度以峰到峰值测量，MEP潜伏期被定义为矫正的肌电图（EMG）信号超过基线EMG水平的平均值加上3个标准差的时间点（TMS脉冲的100至0毫秒）。在运动皮层中FDI肌肉的表示（热点）被定义为TMS引发**且最一致的MEPs的位置，并将热点设为经颅超声刺激（TUS）的目标。 （B）单脉冲和双脉冲TMS范式引发的MEPs的代表性示例。使用双脉冲TMS测量短间期皮层内抑制（SICI）和皮层内促进（ICF）。亚阈条件刺激（CS）后是通过相同的TMS线圈以2毫秒的间隔（SICI）和10毫秒的间隔（ICF）传递的超阈测试刺激（TS）。

图2：重复TUS实验范式。 （A）theta burst模式的TUS（tbTUS）是一个80秒的超声爆发训练，每200毫秒重复一次，每个爆发持续20毫秒。

（B）常规重复模式的TUS（rTUS）由500毫秒的脉冲超声刺激组成，脉冲持续时间为0.32毫秒，脉冲重复频率为1,000Hz，每1.6秒重复一次，总共持续80秒（50次脉冲超声刺激）。tbTUS和rTUS的总超声刺激持续时间均为8秒。ISI = 刺激间隔；SD = 超声刺激持续时间。

（C）分别以随机顺序将三种重复TUS范式（tbTUS、rTUS和sham tbTUS）应用于运动皮层。在TUS之前（基线/Pre）以及在TUS后的5、30和60分钟（T5、T30和T60）测试TUS对运动皮层兴奋性的影响。TMS测量的运动皮层兴奋性包括运动诱发电位（MEP）幅度、静息运动阈（RMT）、MEP招募曲线（RC）、短间期皮层内抑制（SICI）和皮层内促进（ICF）。

被试和方法

被试

我们研究了20名健康右撇子受试者（12名女性，年龄范围为23-49岁，平均年龄标准差[SD]为30.8 7.5岁）。参与者中没有人正在服用已知会影响大脑兴奋性的药物，也没有神经系统或精神障碍的病史。一些受试者参与了多个子研究，所有研究访问之间至少间隔1周。每个子研究的参与者数量在每个实验下说明。该研究获得了多伦多大学健康网络研究伦理委员会的批准。所有受试者提供了书面知情同意，并根据《赫尔辛基宣言》执行了实验程序。

超声刺激运动皮层

本研究采用了定制的2元环形阵列超声换能器（H246; Sonic Concepts, Bothell, WA），基频为0.5MHz，直径为38mm，厚度为10mm。通过可编程的射频放大器（Transducer Power Output System TPO201-80, Sonic Concepts）通过50Ω阻抗匹配模块向换能器提供所需功率。根据头皮到手部运动区的皮层距离，所有实验中的声波深度设置为30mm。

通过经颅磁刺激（TMS）揭示了左侧运动皮层中右侧**背间骨肌（FDI）肌肉的运动表征（热点），作为TUS的目标。热点被定义为在该位置上，通过将线圈的手柄向后和向侧后约45°（后-前[PA]方向）施加TMS可以引发**且最一致的运动诱发电位（MEPs）。然后，在头骨上用笔标记热点，以使超声换能器居中于目标上，并确保实验过程中TMS线圈的可靠重新定位。超声换能器直接放置在定义的热点上，该处涂有导电凝胶（Wavelength MP Blue Multi-Purpose Ultra- sound Gel, Sabel Med, Oldsmar, FL）。

测量运动系统兴奋性

为了测量运动皮层兴奋性的变化，记录了右侧FDI肌肉的MEPs。使用连接到4个Magstim（Whitland, UK）200²刺激器的“四合一”连接盒，将TMS应用于左侧运动皮层，使用一个8字形70mm线圈。通过一对9mm直径的表面Ag-AgCl电极以腹腱联合的方式记录MEPs。肌电图（EMG）信号经过放大（1K，Model 2024F; Intronix Technologies Corporation, Bolton, Ontario, Canada），滤波（带通20Hz-2.5kHz），以5kHz的采样率（Micro 1401; Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK）进行数字化，并存储在实验室计算机中进行离线分析。

实验1：定量声场测绘

使用校准的光纤水听器（HGL-0400; Onda Corp, Sunnyvale, CA）与前置放大器（AG-2010, Onda Corp）相连，测量了声波的声强分布。水听器和换能器被浸泡在一个装满去气、去离子和蒸馏水的水箱中。水听器安装在一个三轴机器人平台上（声学测量水箱; Acertara, Longmont, CO），使用光学机械组件（Edmund Optics, Barrington, NJ和Thorlabs, Newton, NJ）。换能器以0.5MHz的基频、30mm的焦距和20W的强度激励。为了在声学焦点（30mm）处表征径向（x和y轴）的声强分布，水听器在3轴机器人平台上以0.2mm的增量平行于换能器面移动，记录在以声学焦点为中心的16cm2平面内的声强分布。沿z轴周围进行纵向扫描，水听器以0.5mm的增量从距离换能器面5mm开始，直到距离换能器面50mm结束。

实验2：使用重复TUS诱导运动皮层可塑性

在15名受试者（8名女性，年龄范围为23-49岁，平均年龄±标准差为30.9±7.5岁）中，以随机顺序在至少相隔1周的不同日子里对左侧运动皮层应用了三种重复TUS范式，分别是tbTUS、rTUS和sham tbTUS。tbTUS范式是一个80秒的20毫秒超声爆发的训练，每200毫秒重复一次（5Hz的PRF，10%的占空比，400个爆发；见图2A）。rTUS范式由500毫秒的脉冲超声刺激组成，PRF为1,000Hz，占空比为32%，每1.6秒重复一次，总共持续80秒（50次超声刺激；见图2B）。tbTUS和rTUS范式的超声功率均设为20W，它们的总超声刺激持续时间相同，为8秒。sham tbTUS范式采用了节律爆发模式，但是换向器被翻转，使得换向器的非活动面与头皮接触，并且超声能量远离头部。在所有3种范式的80秒重复TUS期间，高斯白噪声由Windows 7计算机的内部声卡产生，并通过耳机传递给参与者，以掩盖来自换向器的听觉刺激，音量设置为参与者能够忍受的最高音量。

如图2C所示，使用TMS诱发的MEPs在4个时间点进行评估：在TUS之前（基线），以及TUS后的5、30和60分钟（T5、T30和T60）。使用保持与头骨切平并向后和向侧后倾斜45°角的线圈诱发MEPs。在TUS干预之前，首先估计诱发MEPs的刺激强度，使其峰峰值幅度约为1mV（SI1mV），并确定静息运动阈（RMT）。以5秒的间隔记录20个SI1mV的MEPs，这个基线刺激强度也用于在TUS干预后的时间点诱发MEPs。RMT被定义为在至少5个连续脉冲中诱发至少50μV的FDI肌肉中最低的刺激器强度。然后，根据RMT确定MEP招募曲线（RC），以提供更详细的皮层兴奋性测量。以伪随机顺序使用以下TMS强度记录10个MEPs：RMT的100%、120%和140%。为了在TUS干预前后保持TMS强度一致，基线RMT也用于确定TUS干预后时间点的RC强度。

为了调查TUS对运动皮层内在电路的影响，我们在TUS干预前后评估了短间期皮层内抑制（SICI）和皮层内促进（ICF）。我们使用相同的TMS线圈通过不同的刺激间隔（ISI）在亚阈值的调节刺激（CS）后提供超阈值的测试刺激（TS）。CS的强度设置为RMT的80%，而TS的强度调整为诱发约1mV（SI1mV）的MEP。SICI在2毫秒的ISI下评估，而ICF在10毫秒的ISI下评估。由于TUS干预后RMT和SI1mv可能会发生变化，因此在评估SICI和ICF时需要在每个时间点估计RMT和SI1mv。每个ISI（2毫秒和10毫秒）和仅使用TS进行了10次MEP收集，共计30次试验。调节MEP的峰-峰幅度以未调节测试脉冲的平均峰-峰幅度的百分比表示。

实验3：颞叶顶叶tbTUS对运动皮层兴奋性的影响

这个对照实验旨在确定tbTUS对颞叶顶叶的传递是否也会改变运动皮层的兴奋性，可能通过间接听觉机制实现。左侧颞叶顶叶被选择为目标区域，因为左侧颞叶顶叶与左侧运动皮层之间的直接解剖和功能连接较少。因此，左侧颞叶顶叶中的tbTUS诱导的可塑性对左侧运动皮层应该几乎没有影响。左侧颞叶顶叶的位置被定义为国际10-20电极EEG系统中的O1位置。我们研究了8名受试者（4名女性，年龄范围为23-43岁，平均年龄SD = 30.2 6.5岁），他们也参与了实验2。除了tbTUS的目标位置外，实验方案与实验2完全相同。

实验4：tbTUS对由不同TMS线圈取向引发的MEP幅度的影响

由于TMS在横向-纵向（LM）方向上产生的电流直接激活皮质脊髓神经元的轴突，而在前后（PA）方向上产生的电流通过内部神经元间接激活皮质脊髓神经元，因此可以利用不同的TMS诱发电流方向来测试tbTUS的作用是否发生在皮质或皮质下水平。我们研究了8位受试者（3名女性，年龄范围为23-49岁，平均年龄SD = 33.8 8.8岁），他们也参与了实验2。通过将TMS线圈的手柄指向侧面，与矢状线垂直90度，实现了面向LM方向的TMS。在基线时分别确定了产生约1mV（SI1mv）MEP所需的PA和LM方向的TMS强度。在将80秒tbTUS传递到运动皮层之前和之后的2分钟内，以随机顺序记录了由PA方向的TMS引发的20个MEP和由LM方向的TMS引发的另外20个MEP，这些MEP的幅度在基线SI1mv时进行记录。

实验5：tbTUS对视运动任务的影响

该实验旨在测量tbTUS对视运动任务中自主运动行为的影响。我们研究了12名右利手的受试者（6名女性，年龄范围为24-44岁，平均年龄SD = 31.3 6.8岁），其中7名受试者还参与了实验2。tbTUS和假tbTUS分别在不同的日期随机顺序应用于左侧运动皮层，两次实验之间至少间隔1周。

在视运动任务中，每个试次以一个蓝色圆圈（直径= 1cm）在屏幕上的起点位置开始，持续2秒钟，以准备受试者，然后一个红色目标圆圈（直径= 2.4cm）以伪随机顺序出现在3个屏幕位置之一：近目标（距离为8cm）、中目标（距离为16cm）和远目标（距离为24cm）。受试者被要求使用右手食指在数字平板上（Intuos Draw；Wacom，Kazo，Japan）迅速而准确地操纵光标，从起点到目标圆圈。在运动过程中，受试者被要求只外展食指，同时保持手、臂和其他手指静止。当受试者在2秒内到达目标圆圈或未能在2秒内到达目标圆圈时，目标圆圈消失，然后在屏幕中央显示一个注视十字架，持续1到2秒，然后进行下一次试次。

每次访问时，实验从一个训练块开始，包含30个试次（每个目标位置10个）。随后，受试者在tbTUS之前和tbTUS之后进行了120次试次（每个目标位置40次）。运动轨迹使用修改后的Psycho- physics Toolbox脚本进行跟踪和分析。对于每个试次，反应时间被定义为目标出现到运动开始的时间，运动时间被定义为运动开始到光标到达目标的时间。此外，还计算了tbTUS之前和之后的准确率。

数据和统计分析

使用Signal软件中的自定义脚本估计了每个试验的峰峰MEP振幅，然后对每个条件进行了平均。由于从同一受试者多次进行了TMS测量，因此应用重复测量方差分析（rmANOVAs）来评估主效应和交互作用。在实验2中，首先使用3个单独的rmANOVAs来比较不同重复TUS范式下的基线RMT、SI1mv和MEP振幅。应用2因素rmANOVA（模式为3个水平：tbTUS、rTUS和sham tbTUS；时间为3个水平：T5、T30和T60）来检查TUS引起的MEP振幅变化。对于这个比较，MEP振幅被表示为相对于基线平均MEP振幅的比率。应用3因素rmANOVA（模式为3个水平：tbTUS、rTUS和sham tbTUS；强度为3个水平：RMT的100%、120%和140%；时间为3个水平：T5、T30和T60）来检查TUS引起的MEP RC变化。为了测试实验2和3中每个TUS范式的时间过程，使用时间（4个水平：Pre、T5、T30和T60）作为因素的rmANOVAs来测试MEP、RMT、SICI和ICF，使用时间（4个水平：Pre、T5、T30和T60）和强度（RMT的100%、120%和140%）作为因素的两因素rmANOVAs来测试MEP RC。对于SICI和ICF，调节的MEP被表示为未调节的MEP振幅（测试刺激）的比率。配对t检验用于比较在实验4中从不同方向的TMS记录的MEP振幅和潜伏期以及在实验5中的运动表现的tbTUS的效果。当检测到球面性违规时，应用Greenhouse-Geisser校正。通过配对t检验进行事后比较。显著性水平设置为p < 0.05，并进行Bonferroni校正以进行多重比较。

实验结果

实验1：TUS的声束特性

通过安装在电动三轴台上的校准水声测量器，在自由水中测量了从TUS换能器传输的声压场。换能器以基频（0.5MHz）、焦距为30mm和放大器强度为20W的方式进行激励。图3显示了相对于声疗路径的纵向平面（ZX）和焦平面（XY）上的声束横截面。在强度半峰全宽处测量的声束横截面的横向和纵向尺寸分别为5.8mm和5.6mm，这使得TUS能够在空间上定位运动皮层。垂直于换能器面的轴向方向上的声场显示出12mm处的近场峰值和33mm处的远场峰值（接近30mm的焦距）。根据声压场，tbTUS和rTUS的空间峰值脉冲平均强度（ISPPA）均为2.26W/cm2，远低于美国食品和药物管理局（FDA）对ISPPA≤190W/cm2的建议。tbTUS的空间峰值时间平均强度（ISPTA）为0.23W/cm2，也低于FDA对ISPTA≤0.72W/cm2的建议。rTUS的ISPTA为0.72W/cm2，处于FDA建议范围内。在整个实验过程中，没有受试者报告任何不良反应，支持当前脉冲方案的安全性。

图3：超声压力场。(A) 在自由水中测量的焦距为30mm的0.5MHz换能器的声强度分布图。纵向图中的白线表示测量声场空间峰值脉冲平均强度的焦平面。右侧显示了焦平面的声束横截面。(B) 线图显示了焦平面声束的横向（x，左图）和垂直（y，中图）峰值归一化声强度分布。在半峰全宽（FWHM）声强度测量的横向和垂直声束横截面的尺寸分别为5.8mm和5.6mm。轴向（z，右图）峰值归一化声强度分布的线图显示近场峰值位于12mm处，远场峰值位于33mm处（接近焦距30mm）。

实验2：重复TUS引起运动皮层可塑性

在TUS期间，没有受试者报告听到换能器发出的任何嗡嗡声，因为通过耳机进行了白噪声掩蔽。tbTUS、rTUS和sham tbTUS的基线RMT和SI1mV相当（RMT：tbTUS [50.1 7.5%刺激器输出，均值标准差]，rTUS [50.7 7.8%]，sham tbTUS [50.9 8.1%]；SI1mv：tbTUS [58.3 9.5%]，rTUS [58.7 9.3%]，sham tbTUS [59.1 9.7%]）。基线MEP幅度在3个TUS会话中也相似，如图4所示，没有任何模式的主要效应显著（tbTUS：0.98 0.17mV [均值标准差]，rTUS：1.03 0.15mV，sham tbTUS：1.01 0.18mV）。

对归一化MEP幅度进行的两因素rmANOVA显示模式的显著效应（F2, 28 = 21.19，p < 0.001），以及模式×时间交互作用（F4, 56 = 3.7，p = 0.01）。模式的事后分析显示tbTUS相对于rTUS（p < 0.001）和sham tbTUS（p < 0.001）具有显著的MEP促进作用，而rTUS和sham tbTUS之间没有显著差异（p = 0.559）。如图4A所示，通过对MEP幅度进行的rmANOVA中的时间因素确认了tbTUS的促进效应（F3, 42 = 5.98，p < 0.001），事后分析显示MEP幅度在T5（p < 0.001）和T30（p = 0.002）显著增加，并在T60时恢复到基线水平（p = 0.118）。图4B显示，在tbTUS后，15名受试者中有14名在T5和T30时MEP幅度增加，与基线相比。rTUS和sham tbTUS对MEP幅度没有产生显著变化（rmANOVA，rTUS的时间效应：p = 0.98，sham tbTUS的时间效应：p = 0.96）。

在每个重复TUS协议后，RMT保持不变（rmANOVA，tbTUS的时间效应：p = 0.992；rTUS：p = 1.0；sham tbTUS：p = 0.999）。对于MEP RC，三因素rmANOVA显示模式（F2, 28 = 5.77，p = 0.008）、强度（F2, 28 = 104.38，p < 0.001）和模式×时间强度交互作用（F8, 112 = 2.17，p = 0.035）的显著效应。模式的事后分析显示tbTUS相对于rTUS（p = 0.03）和sham tbTUS（p = 0.018）具有显著的MEP RC促进作用，而rTUS和sham tbTUS之间没有显著差异（p = 0.696）。对于tbTUS的MEP RC，二因素rmANOVA显示时间（F3, 42 = 8.39，p < 0.001）和时间×强度交互作用（F6, 84 = 5.27，p < 0.001）的显著效应。事后测试显示，在T5和T30时，与基线相比，MEP幅度在RMT的120%和140%强度下显著增加（见图4C）。对于rTUS和sham tbTUS的MEP RC（见图4C），rmANOVA显示时间或时间×强度交互作用没有显著效应。

图4：重复经颅超声刺激（TUS）对运动皮层兴奋性的影响。(A, B) 重复TUS对运动诱发电位（MEP）幅度的影响。TUS后的MEP幅度以基线（Pre）的平均MEP幅度比率表示。(A) 图中展示了所有受试者在TUS前后的平均MEP。θ突发模式TUS（tbTUS）后观察到明显的MEP促进效应，持续至少30分钟。规则模式TUS（rTUS）和sham tbTUS对MEP幅度没有明显影响。**p < 0.01，**p < 0.001与tbTUS基线相比（Bonferroni校正）。误差条代表均值的标准误差。(B) 圆圈（左图）、方块（中图）和菱形（右图）分别表示tbTUS、rTUS和sham tbTUS的个体数据。15名受试者中有14名在tbTUS后的5分钟（T5）和30分钟（T30）MEP幅度较高。(C) 重复TUS对MEP招募曲线（RC）的影响。RC在基线静息运动阈值（RMT）的100%、120%和140%的TMS强度下记录。tbTUS（左图）在T5和T30时观察到明显的MEP促进效应，强度为RMT的120%和140%。rTUS（中图）和sham tbTUS（右图）后的MEP RC没有明显差异。，#与T5和T30的基线相比显著不同（Bonferroni校正后，p < 0.05）。

图5显示了重复TUS对运动皮层内皮回路的影响。rmANOVA显示tbTUS对SICI（F3, 42 = 5.65, p = 0.002）和ICF（F3, 42 = 4.36, p = 0.008）都有显著的时间主效应。事后检验显示，与基线相比，T5时SICI显著降低（p = 0.002），T30时也显著降低（p = 0.031），而T5时ICF显著增强（p = 0.018）。相比之下，rTUS和sham tbTUS对SICI和ICF均没有影响，rmANOVA的时间因素效应均不显著（SICI：rTUS [p = 0.126]，sham tbTUS [p = 0.259]；ICF：rTUS [p = 0.96]，sham tbTUS [p = 0.958]）。

图5：重复经颅超声刺激（TUS）对短间期皮层内抑制（SICI）和皮层内促进（ICF）的影响。记录了SICI和ICF在TUS之前（Pre），以及在T5、T30和T60分钟（T5、T30和T60）后的数据。数据以未经条件刺激的运动诱发电位幅度（测试刺激[TS]）的比率绘制。小于1的值表示抑制，大于1的值表示促进。结果显示，经过θ突发模式的TUS（tbTUS）在T5和T30时显著降低了SICI（A），而经常模式的TUS（rTUS）（B）和虚拟tbTUS（C）对SICI的影响不显著。ICF在tbTUS后的T5时显著增加（D），而rTUS（E）和虚拟tbTUS（F）后ICF无显著变化。误差线表示均值的标准误差。*与基线显著不同（经过Bonferroni校正，p < 0.05）。

实验3：颞叶皮层tbTUS对运动皮层兴奋性的影响

在8名受试者中，记录了TMS测量数据，包括在对颞叶皮层进行tbTUS之前（Pre）以及在之后的5分钟、30分钟和60分钟（T5、T30和T60）。rmANOVA分析结果显示，颞叶皮层tbTUS对MEP幅度（p = 0.935）、RMT（p = 0.945）、SICI（p = 0.993）和ICF（p = 0.985）的时间效应均不显著（图6）。对于MEP RC，rmANOVA分析显示强度的效应显著（F2, 14 = 82.16, p < 0.001），但时间效应（F3, 21 = 0.04, p = 0.987）和时间×强度交互作用效应（F6, 42 = 0.06, p = 0.99）均不显著。这些结果表明，在颞叶皮层tbTUS后，运动皮层兴奋性没有显著变化。

图6显示了颞叶皮层θ突发模式经颅超声刺激（tbTUS）对运动皮层兴奋性的影响。从左侧颞叶tbTUS之前（Pre）和在之后的5分钟、30分钟和60分钟（T5、T30和T60）记录了右侧**背间骨肌的运动诱发电位（MEP）。空心圆和实心圆表示个体和平均MEP数据。每个时间点的MEP幅度相对于基线MEP（Pre）表示。SICI和ICF相对于未经条件刺激的MEP（测试刺激[TS]）表示。RC记录在静息运动阈值（RMT）的100％、120％和140％强度下。所有测量结果表明，颞叶皮层tbTUS不会改变运动皮层的兴奋性。误差线表示均值的标准误差。TMS = 经颅磁刺激。

实验4：tbTUS对不同TMS线圈方向诱发MEP振幅的影响

对于PA方向的TMS，SI1mv占刺激输出的平均值为59.7 ± 11.2％（均值 ± 标准偏差），LM方向的TMS则为63.8 ± 11.9％。基线MEP潜伏期对于PA方向的TMS为23.1 ± 1毫秒（均值 ± 标准偏差），LM方向的TMS为21.7 ± 0.9毫秒（图7）。PA方向的TMS诱发的MEP潜伏期显著长于LM方向的TMS（t = 4.08，p = 0.005）。LM方向的TMS诱发的MEP振幅在tbTUS的作用下未发生显著变化（t = 0.71，p = 0.495），而PA方向的TMS诱发的MEP振幅在tbTUS的作用下显著增加（t = 5.94，p < 0.001），并且观察到这种效应在8名受试者中都存在。

图7：θ爆发模式经颅超声刺激（tbTUS）对不同经颅磁刺激（TMS）诱发电流方向引发的运动诱发电位（MEPs）的影响。

（A）LM方向的TMS和PA方向的TMS诱发的MEP潜伏期。PA方向的TMS诱发的MEP潜伏期显著长于LM方向的TMS（p < 0.01）。

（B）LM方向的TMS诱发的MEP振幅在tbTUS后未发生显著变化。

（C）所有8名受试者在tbTUS后PA方向的TMS诱发的MEP振幅显著增加（p < 0.001）。空心圆圈和方块表示个体数据。实心圆圈和方块表示均值数据。**p < 0.01，***p < 0.001，经过配对t检验。

实验5：tbTUS对视运动任务的影响

如图8A所示，在视运动任务中，目标随机出现在3个位置中的一个，参与者使用食指将光标从起点移动到目标圆圈。运动轨迹被跟踪以测量准确率、反应时间和运动时间。图8B–D显示了汇总的准确率、反应时间和运动时间。在伪刺激tbTUS后，这三个指标均保持稳定。真实的tbTUS显著减少了运动时间（t = 2.62，p = 0.024），但对准确率和反应时间没有影响。

图8：θ爆发模式经颅超声刺激（tbTUS）对视运动任务的影响。

（A）视运动任务。目标随机出现在3个位置之一（T1、T2和T3），参与者使用数字平板上的右手食指将光标从起点移动到目标圆圈。

（B–D）假性或真实tbTUS前后的准确率、反应时间和运动时间。在假性tbTUS后，运动表现保持不变。真实的tbTUS对准确率和反应时间没有影响，但明显缩短了运动时间。误差棒表示均值的标准误差。*p < 0.05，经过配对t检验。

讨论

本研究结果显示，以θ爆发模式传递的重复性TUS可增加人类运动皮层的兴奋性，至少在30分钟内可通过TMS诱发的MEP振幅的变化来观察到。此外，tbTUS还调节了通过SICI和ICF测量的抑制性和兴奋性皮质内环路，但LM方向的TMS诱发的MEP振幅保持不变。行为研究表明，传递到运动皮质的tbTUS增强了运动表现。相比之下，常规rTUS、假性tbTUS和枕叶tbTUS对运动皮质的兴奋性没有影响。总的来说，这些观察结果表明tbTUS引发了皮质可塑性，改变了人类运动皮质功能。

tbTUS引发的可塑性的皮层部位

TMS诱发的MEP振幅反映了皮质脊髓兴奋性，可以受到皮质和脊髓水平兴奋性的变化的影响。TMS激活的皮质环路取决于诱发的电流方向。LM方向的电流直接激活皮质脊髓轴突并更倾向于招募直接（D）波，而PA方向的电流通过皮质间神经元在经过突触途径上激活锥体神经元，主要招募早期间接（I）波。因此，通过PA方向的TMS诱发的MEP对皮质兴奋性的变化非常敏感，但通过LM方向的TMS诱发的MEP则不敏感。在我们的研究中，LM方向的TMS诱发的MEP潜伏期比PA方向的TMS诱发的MEP潜伏期短1到2毫秒（参见图7A），这与以前的研究一致，可以解释为经颅电刺激产生的D波和**个I波之间的潜伏期差异。由于tbTUS增加了通过PA方向的TMS诱发的MEP振幅，但不影响通过LM方向的TMS诱发的MEP振幅，因此tbTUS引发的可塑性主要发生在皮质水平。然而，我们不能完全排除微弱的脊髓效应。

SICI可能是由于人类运动皮质中的γ-氨基丁酸A（GABAA）受体介导的抑制，因为增强GABA能神经递质传递的药物会增加SICI。有证据表明SICI起源于皮质而不是亚皮质或脊髓水平，因为磁刺激条件刺激抑制了由超阈值TMS诱发的反应，但没有抑制由主要诱发D波的经颅电刺激诱发的反应，而且它可以通过次阈值条件刺激诱发，而次阈值条件刺激不能激活皮质脊髓神经元。此外，从硬膜脊髓电极记录的脊髓传导波显示，SICI抑制了后期的I波，但没有抑制TMS诱发的D波，这表明SICI是由运动皮质内的突触抑制引起的。tbTUS后SICI的减少表明tbTUS抑制了运动皮质中的皮质-皮质抑制环路。ICF可能是由谷氨酸介导的，因为它受到谷氨酸受体拮抗剂右美沙芬的抑制。28与SICI类似，ICF也是由皮质机制引起的，但它测试的是兴奋性的皮质环路。tbTUS后ICF的增加表明tbTUS增强了运动皮质中的皮质-皮质兴奋环路。综合起来，tbTUS改变了运动皮质中抑制和兴奋的平衡，使其倾向于更少的抑制和更多的兴奋。

人类超声刺激后效应的先前研究

一些研究发现了人类超声刺激的后效应。将20分钟的超声刺激传递到前丘脑会在声学作用后的10分钟产生镇痛效应。另一项研究报告称，将30秒的超声刺激传递到右侧额下回会在声学作用后的30分钟内诱发积极的情绪变化，而2分钟的超声刺激则减少了与情绪和情绪调节相关的休息状态网络的功能连接。这些研究与我们的发现一致，即超声刺激可以在人类中产生至少30分钟的离线效应。

一些研究报告了非定位性诊断性超声刺激在人类中的离线效应。将2分钟的诊断性超声刺激应用于运动皮质可以增加皮质脊髓兴奋性，持续6分钟。另一项研究表明，将3分钟的诊断性超声刺激定向到上丘增加了声学作用后的3分钟内的脑干环路的兴奋性。这些研究中使用的基本频率为2.32MHz和1.75MHz，与TUS使用的较低频率（约500kHz）相比，这些频率导致声能在颅骨中的衰减较大。这可能与诊断性超声刺激的短暂后效应有关。

tbTUS在诱发可塑性方面具有很高的效力

tbTUS具有相对较大的效应大小和可接受的个体间变异性，因为在刺激后5分钟的平均MEP振幅变化百分比为43.1 ± 25.1%（均值 ± 标准偏差），30分钟后为27.5 ± 23.7%。目前用于增加皮质兴奋性的NIBS协议，如兴奋性的配对联合刺激（PAS）、高频rTMS、阳极tDCS和间断性θ爆发TMS（iTBS），在个体之间高度变异。先前的研究报告称，在进行30分钟PAS后，MEP振幅的平均变化百分比为27.1 ± 46.7%，进行20次10Hz rTMS（每次80脉冲，间脉冲间隔52秒，20分钟）后，MEP振幅的平均变化百分比为37.9 ± 53.6%，以及应用2mA阳极tDCS进行10分钟后，MEP振幅的平均变化为38 ± 53%。对180名受试者进行的iTBS（600脉冲，3分钟）效应的大规模分析显示，在刺激后5至10分钟，MEP振幅增加了22.9 ± 54.6%，在刺激后20至30分钟，MEP振幅增加了20.4 ± 27.8%。因此，tbTUS的效应大小至少与现有的NIBS协议相媲美，甚至可能更高。此外，我们研究中的实验1中的15名受试者中有14名以及实验4中的8名受试者中的所有受试者在tbTUS后MEP振幅均增加。相比之下，一项测试了PAS、tDCS和iTBS的研究在56名受试者中发现，只有39%、45%和43%的受试者分别有促进性反应。对NIBS协议的反应变异性可能取决于刺激参数，如频率、强度和持续时间。然而，几乎所有之前评估了当前NIBS协议的变异性的研究都发现，三分之一到一半的受试者未能以“规范”的方式对干预做出反应。还应注意的是，我们的tbTUS仅需要80秒的刺激时间，这比前述的兴奋性NIBS协议，包括PAS（30分钟）、10Hz rTMS（20分钟）、tDCS（10分钟）和iTBS（3分钟）都要短。因此，tbTUS有可能成为一种强大而高效的协议，用于增加运动皮质的兴奋性。

对潜在混淆效应的控制

TUS对神经活动的调节效应可能会受到听觉效应的混淆。一项人体研究使用EEG记录发现，在TUS期间存在听觉激活，而这种TUS诱发的听觉EEG信号可以通过通过耳机向参与者传递听觉刺激来消除。动物研究表明，超声神经调制由于TUS诱发的耳蜗振动而产生广泛的皮质激活，而这种激活模式在不同的超声刺激位置之间保持一致。尽管TUS期间的在线观察可能不适用于我们的研究，因为我们研究了TUS的后效应，但潜在的听觉或其他感觉副作用存在的情况需要足够的刺激掩盖和假刺激对照。在当前研究中，我们通过耳机向受试者传递白噪声，以掩盖重复性TUS期间的听觉效应。此外，我们还进行了两个对照实验。一个对运动皮质进行了假刺激，以解释可能由tbTUS诱发的听觉和其他非特异性效应，另一个对同侧枕叶皮质进行了活动刺激，以解释听觉和非特定部位的tbTUS效应（如触觉或刺痛感觉）。因为我们在声音遮蔽的情况下诱发了皮质可塑性，并且这些变化在两个对照实验中没有观察到，所以tbTUS诱发的可塑性不太可能与感觉混淆有关。

tbTUS对运动行为的影响

tbTUS调节了自愿运动激活的神经回路，因为在刺激后的视运动任务中，运动时间缩短了。当前的研究结果支持了神经可塑性模型，这些模型支持了改善运动表现的神经可塑性。主要运动皮质在形成新的或调整现有的运动技能方面发挥着重要作用，这一点在与改善表现相关的人类皮质运动输出的调节中得到了体现，这些调节发生在串联反应时间任务期间。在我们的研究中，准确率没有改变，可能是由于准确率在基线时（见图8B）已经很高（约98%），因此达到了天花板效应。目前还不清楚为什么tbTUS会影响运动时间但不影响反应时间，但是运动皮质可能在运动执行方面的作用比在刺激评估方面的作用更大。这与以下观察相似：在刺激运动皮质后，拇指屈曲运动的加速度在立即增加，无论是通过兴奋性还是抑制性PAS进行刺激；而在帕金森病患者中，额外运动区的阳极tDCS减少了运动时间，但没有改变反应时间。44我们没有考察tbTUS对运动任务的效应时间过程。这些行为结果应被视为初步的，未来的研究可以探讨tbTUS对运动行为、学习和认知的详细影响。

tbTUS诱导可塑性的潜在机制

tbTUS增加了MEP振幅和RC的斜率，但未改变RMT。与接近RMT的较低强度相比，用于1mV MEP和RC的TMS强度会激发阈值较高的神经元。药理学研究显示，RMT会受到电压门控钠通道拮抗剂的影响，代表轴突兴奋性，而MEP振幅和RC受到谷氨酸、GABA和去甲肾上腺素、5- 羟色胺等神经递质以及神经调节递质的调控。这些神经递质系统可能参与了tbTUS的效应介导。tbTUS诱导的可塑性持续了30到60分钟。这种可塑性变化的持续时间不太可能是由于类似短时增强的可塑性，其持续时间为毫秒到几分钟。相反，可塑性变化的持续时间可能与类似LTP的现象一致，根据定义，LTP持续时间超过30分钟。18然而，其他潜在机制，如跨膜蛋白或胶质细胞的变化，也可能涉及其中。这种可塑性是特定于tbTUS的，因为在具有更短脉冲（0.32毫秒）和更高脉冲重复频率（1,000Hz）的常规模式TUS之后，未观察到皮质兴奋性的变化，尽管这两种协议具有相同的声学作用总持续时间（8秒）和总刺激时间（80秒）。tbTUS中使用的刺激特征类似于用于在体外研究中诱导类似LTP的可塑性的刺激特征，该研究显示，将40秒的100毫秒超声脉冲以5Hz的频率传递给大鼠皮质神经元可增加动作电位的发放时间长达8小时。此外，几项体内研究发现，采用脉冲持续时间为30至50毫秒和PRF为10Hz的TUS协议后，产生了后效应。我们之所以采用5Hz而不是10Hz的PRF原因如下：(1) 5Hz的θ频率下的模式刺激在0.5、1、5和10Hz的脉冲频率中是**的，用于诱导海马区LTP；48,49(2) 在相同的脉冲长度下，较低的重复频率意味着较低的占空比，相应的组织加热风险较低；(3) 以前的研究发现，占空比较低的TUS（10%）在短暂调节运动皮质兴奋性方面比较高占空比（30%和50%）的TUS更有效。然而，不同PRF如何影响人脑可塑性的诱导尚不清楚，需要在未来的研究中进行探讨。

关于TUS与生物组织相互作用的机制，已经提出了几种机制，包括诱导局部加热和机械力。所涉及的机制取决于声学参数（频率、强度、脉冲持续时间和占空比），从而导致热效应或机械效应。tbTUS的ISPTA为0.23W/cm2，远低于FDA建议的ISPTA≤0.72W/cm2，不太可能产生明显的脑组织加热。

此外，组织温度的升高会减少而不是增强其兴奋性。因此，tbTUS在运动皮质上观察到的效应很可能与非热效应有关。虽然我们尚不完全了解tbTUS如何通过机械力激发神经元，但它可能会诱发机械敏感的电压门控钠通道和钙通道的激活。尽管动物研究已经显示TUS可以增加神经元的放电，但我们所使用的tbTUS范式是否会激活人类运动皮质中的神经元，以及这些机制与动物中使用的θ爆发刺激协议或人类TMS之间的关系，需要在进一步的研究中澄清。

限制和未来研究

当前研究存在一些限制。首先，未使用神经导航来引导和监测TUS换能器和TMS线圈的位置。使用神经导航可能会减少MEP的变异性。然而，对于运动皮质刺激，可以根据在给定刺激强度下TMS引发最高和最一致的MEP振幅的头皮位置有效地定义FDI肌肉的运动皮质代表区。先前的研究显示，在运动皮质TMS中使用神经导航只有最小的优势。54,55其次，我们没有探讨tbTUS的一系列声学参数（如PRF、占空比、声学持续时间和声学强度）对皮质可塑性诱导的影响。此外，确定在1天内或多天内进行多次tbTUS会产生更大效应将会很有趣。因此，未来的研究需要确定**的tbTUS参数，通过系统性测试更广泛的声学参数范围来**化效果，同时确保安全。最后，tbTUS对其他皮质和亚皮质区域的影响没有进行测试。我们选择以运动皮质为目标，因为我们可以通过TMS诱发的MEP振幅来测量对皮质兴奋性的客观测量。对于其他脑区域，可以使用脑电图、功能磁共振、正电子发射断层扫描和行为测量等脑图技术来测试tbTUS诱导可塑性的效应。

对临床干预的影响

tbTUS在人类中诱发的类似LTP的可塑性对临床实践具有重要潜在意义，特别是对于治疗帕金森病、本体性震颤、抑郁症、焦虑症和意识障碍等神经和精神疾病。神经和精神疾病的治疗通常涉及重复应用NIBS。例如，FDA和其他监管机构已批准重复应用高频rTMS和iTBS治疗抗药性抑郁症的左背外侧前额叶皮质。此外，高频rTMS治疗运动皮质的重复疗程被认为对于神经性疼痛和帕金森病的运动症状有效。由于tbTUS似乎是一种在人类中产生类似LTP的皮质可塑性的有效和可靠方法，因此它有望成为治疗神经和精神疾病的新型非侵入性神经调节治疗技术。

与当前的NIBS技术相比，TUS的一个重要优势是具有高空间分辨率，可以局部靶向深脑区域。因此，未来的研究可以使用tbTUS来刺激与神经和精神疾病相关的深脑区域。初步研究报告称，对临床上意识障碍患者的10次30秒声音刺激后，有3名患者中的2名表现出明显的行为反应增加，超声脉冲持续时间为0.5毫秒，PRF为100Hz，刺激的是丘脑区域。一项动物研究显示，在帕金森病小鼠模型中，对亚丘脑核的TUS可以减少异常的皮质β-γ耦合，这重复了治疗性深脑刺激（DBS）的效应。由于深脑区域只能通过DBS等侵入性技术访问，而无法通过当前估计的NIBS技术访问，tbTUS可能为需要调节深脑区域的神经调节的疾病提供了独特的非侵入性治疗选择。

论文原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ana.26294

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